SPAD陣列在共聚焦顯微鏡中的超分辨率成像應(yīng)用——基于波動(dòng)對比度的SOFISM方法

隨著成像技術(shù)的不斷進(jìn)步，許多微觀世界的奧妙被人類不斷的發(fā)現(xiàn)和記錄下來，成為科技進(jìn)步的重要研究工具。但是傳統(tǒng)遠(yuǎn)場光學(xué)顯微鏡受到“阿貝衍射極限"的限制，在空間分辨率上存在天然瓶頸，導(dǎo)致很多領(lǐng)域的研究受到了阻礙。近年來，雖然有如STED、PALM、STORM等超分辨率顯微技術(shù)不斷成熟，但這些方法對設(shè)備配置和操作要求較高，實(shí)驗(yàn)復(fù)雜性大，價(jià)格昂貴，難以滿足當(dāng)今快速發(fā)展的科學(xué)研究。

相比之下，一種被稱為圖像掃描顯微技術(shù)（Image Scanning Microscopy, ISM）的方法正在受到關(guān)注。該方法僅需替換探測器并更改成像分析方案，便可實(shí)現(xiàn)分辨率與圖像對比度的提升，具備較強(qiáng)的實(shí)用性。

為進(jìn)一步突破成像分辨率，同時(shí)保持系統(tǒng)的簡潔性，研究人員將單光子雪崩二極管陣列（SPAD array）與ISM方法結(jié)合，提出了一種新型超分辨率成像方案——SOFISM（Super-resolution Optical Fluctuation Image Scanning Microscopy）。本文也是針對此方法，做了一些原理方面的論述，同時(shí)講述了一些研究成果和應(yīng)用方向，歡迎大家來電討論溝通。

技術(shù)原理與系統(tǒng)構(gòu)成

1.   SOFISM的工作原理

該技術(shù)在傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上，進(jìn)行如下改造：

1. - 用23像素的陣列SPAD替代共聚焦中的點(diǎn)探測器

2. - 每當(dāng)激光掃描樣本時(shí)，SPAD陣列會(huì)記錄下每個(gè)像素檢測到的光子到達(dá)時(shí)間

3. - 系統(tǒng)將陣列中任意兩個(gè)像素組合，計(jì)算其二階或更高階相關(guān)函數(shù)

4. - 相關(guān)函數(shù)用于重建圖像，可有效增強(qiáng)對比度并提升分辨率

SOFISM的圖像增強(qiáng)效果，主要來自兩個(gè)方面：

1. - 單個(gè)SPAD像素的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）變窄（提升√2倍分辨率）

2. - 不同像素之間的相關(guān)計(jì)算進(jìn)一步提升分辨率（zui終可達(dá)4倍）

2.  SPAD陣列的優(yōu)勢

SPAD陣列是一種基于cmos工藝制造的光子探測器，具備以下突出特點(diǎn)：

1. - 可實(shí)現(xiàn)單光子探測且內(nèi)置了tdc

2. - 具備20ps的時(shí)間分辨率

3. - 能實(shí)時(shí)的快速數(shù)據(jù)采集和傳輸

4. - 陣列化布局可拓展為高分辨率圖像傳感實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與成像效果

研究團(tuán)隊(duì)采用了CdSe/CdS/ZnS核殼結(jié)構(gòu)的量子點(diǎn)樣本進(jìn)行實(shí)測。

分別獲得了以下圖像結(jié)果：

1. - CLSM圖像：普通共聚焦圖像，存在明顯的模糊與噪聲

2. - ISM圖像：清晰度提升至原來的2倍，噪聲降低

3. - SOFISM（二階相關(guān)）：分辨率提升至約2.5倍

4. - SOFISM（四階相關(guān)）：分辨率理論上可達(dá)原始圖像的4倍

在整個(gè)過程中，每個(gè)像素僅需幾毫秒的駐留時(shí)間，即可完成高信噪比圖像采集，非常適合動(dòng)態(tài)樣本或弱熒光場景的測量需求。

系統(tǒng)核心配置

系統(tǒng)關(guān)鍵核心硬件如下：

1. - 激發(fā)光源：標(biāo)準(zhǔn)共聚焦激光掃描器

2. - 探測器：單光子陣列探測器

本次實(shí)驗(yàn)所使用的單光子陣列探測器—SPAD23，它之所以非常適合應(yīng)用于SOFISM超分辨率顯微成像系統(tǒng)，主要是因?yàn)樗亩鄠€(gè)核心特性正好匹配該成像方案的技術(shù)需求與成像邏輯。其優(yōu)勢如下：

單光子靈敏度

SOFISM依賴熒光信號中的微弱強(qiáng)度波動(dòng)，這些波動(dòng)往往涉及單光子級別的統(tǒng)計(jì)變化。SPAD23具備真正的單光子探測能力，可以高效捕獲微弱的熒光閃爍事件，為后續(xù)的相關(guān)性計(jì)算提供了高SNR的輸入數(shù)據(jù)。

PS級時(shí)間分辨率（20ps）

SOFISM的核心是對熒光發(fā)射過程中的時(shí)間相關(guān)性進(jìn)行計(jì)算。SPAD23每個(gè)像素都集成了一個(gè)20 ps分辨率的TDC（時(shí)間數(shù)字轉(zhuǎn)換器），可實(shí)時(shí)記錄光子到達(dá)時(shí)間，為高階相關(guān)函數(shù)（如二階、四階）提供數(shù)據(jù)，基礎(chǔ)SOFISM中越高階的相關(guān)函數(shù)越需要時(shí)間分辨率高，SPAD23的10ps Bin寬和20ps的時(shí)間戳精度可以提供有力的支撐。

陣列結(jié)構(gòu)支持多像素關(guān)聯(lián)計(jì)算

SOFISM通過多個(gè)像素之間的協(xié)同工作進(jìn)行圖像重建。SPAD23采用六邊形排列的23像素陣列結(jié)構(gòu)，不僅提升了視場范圍，還允許計(jì)算23個(gè)像素對的時(shí)間相關(guān)性，這對于圖像分辨率增強(qiáng)至關(guān)重要。SOFISM計(jì)算跨像素相關(guān)性，SPAD23提供了充足的像素?cái)?shù)量和布局密度，確保成像精度和算法穩(wěn)定性。

高填充因子和光子收集能力

SOFISM需要快速、高信噪比成像，SPAD23的像素填充因子超過80%，單像素尺寸為23μm，光敏面達(dá)1.3mm×1.3mm，有效提升了光子收集效率。這對于弱熒光樣本尤為重要，可減少曝光時(shí)間與激發(fā)強(qiáng)度。SPAD23的高光敏設(shè)計(jì)極大優(yōu)化成像效率。

互不干擾的獨(dú)立工作機(jī)制

SOFISM成像中每個(gè)像素都承擔(dān)獨(dú)立信號通道的角色。SPAD23的每個(gè)SPAD + TDC模塊彼此互不影響死時(shí)間，可以實(shí)現(xiàn)并行、高效的數(shù)據(jù)采集，避免了光子堆積導(dǎo)致的信息丟失。

緊湊集成的體積設(shè)計(jì)

傳統(tǒng)的SPAD + 多通道TDC系統(tǒng)通常龐大而復(fù)雜，而SPAD 23將所有探測器與時(shí)間采集電路集成在一塊微型模塊上，體積僅為半部手機(jī)大小，非常適合放置于現(xiàn)有共聚焦系統(tǒng)的成像面上。

應(yīng)用優(yōu)勢

高分辨率、高對比度

1. - 在不引入額外復(fù)雜光學(xué)路徑的前提下，實(shí)現(xiàn)2-4倍分辨率提升，SPAD 93的問世，可以更進(jìn)一步的提高分辨率

2. - 有效抑制熒光閃爍帶來的圖像噪聲

簡單易用、集成度高

1. - 不需調(diào)整光路或添加特殊探測模塊

2. - 結(jié)合SPAD的高速響應(yīng)，可兼容高速活體成像

適配性強(qiáng)、兼容主流共聚焦平臺(tái)

1. - 可作為傳統(tǒng)共聚焦系統(tǒng)的升級模塊

2. - 特別適用于高時(shí)間分辨、低光照、活細(xì)胞熒光研究

SOFISM方法結(jié)合SPAD陣列的時(shí)間靈敏性與圖像掃描顯微的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢，為生物顯微成像提供了一種“低成本 + 高性能"的超分辨解決方案

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